Laboration dag 4 - Tisdag 20/9 2011

Syftet med fjärde dagens laboration var att genomföra en stringenstvätt av den hybridiserade membranet samt utföra en detektion med NBT och BCIP.    

Fjärde dagens laboration var kortade än den föregående och inte så ansträngande - vilket var mycket skönt. Förra laborationen avslutades med prehybridisering och hybridisering. Prehybrediseringen var viktig för att "blockera" nylonmembranet från att binda till proberna. Om endast hybridisering gjordes skulle hela membranet ha prober bundna till sig och inte bara till självaste DNA:t, vilket är då meningen.

Stringenstvätt av hybridiseringen utfördes två gånger. Första gången tvättades nylonmembranet med 2xSSC och 0.1% SDS för att ta bort de prober som ej har bundit till något - en låg stringenstvätt. Den andra tvättningen var en hög stringenstvätt och 0.1XSSC samt 0.1% SDS användes instället. Båda tvätten tog 15 minuter vardera att utföra, där den första skedde i rumstemperatur och den andra vid 65 grader.

Efter stringenstvätten tillsattes DIG-märkta antikroppar till membranet, efter att det hade "blockerats" med Buffert 1 innehållande 0.5% Blockerings reagens. Blockeringen i detta steg var viktig för att antikropparna skulle bilda endast till proberna och inte till membranet. De överflödiga antikropparna tvättades av för att sedan tillsätta 200µL NBT/BCIP (substrat) med buffert 1 till membranet för att en "blå" (i denna laboration brun) produkt skulle bildas (i mörker). Den bruna produkten, om laborationen gick rätt till, skulle bildas endast där prober hade bundit till DNA:t inklusive den sökta genen LL37. Resultatet kan skådas i bilden nedan.

Bild I: jämförelse mellan elektroforesen (dag 3) och membranet (dag4)

Syftet med metoderna PCR och Southern (dag 2 respektive dag 3 och 4) var att detektera om LL37-genen fanns i plasmiden. PCR var mycket lättare att utföra, den innefattade inte så många steg som Southern, vilket kan vara en fördel för en säkrare resultat. Skulle man glömma ett steg i Southern som exempelvis fixering av membranet, eller vända gelen fel på sätt på membranet eller hoppa över prehybridiseringen, då är det stor risk att man inte får någon resultat. Däremot är resultatet för Southern mycket känsligare än endast PCR och elektrofores. I elektroforesen till exempel från dag 3, kan man inte se något band för den klyvda plasmiden med den minsta koncentrationen (0.005µg), däremot dyker bandet upp på membranet efter tillsats av substrat. Detta innebär att även mycket små mängder som har vandrat i elektroforesen, men syns, kan i nästa steg - Southern, detekteras med hjälp av prober, antikroppar och substrat. Se bild I.

Efter dessa fyra långa, jobbiga men ändå intressanta dagar på lab, känner jag att jag har lärt mig en hel del. Förra terminen tillhörde jag gruppen som utförde PCR, självaste elektroforesen fick andra göra. Detta har lett till att jag inte förstod fullt ut vad elektrofores innebär och hur det fungerar. Under tiden som Southern utfördes har jag lärt mig att vara observant på de angivelser som står i häftet och att inte ha för bråttom. Då vår gel läckte ut hela tiden under dag 3, har jag lärt mig hur man kan förhindra detta redan från början för att spara tid och material. Generellt sett har jag blivit bättre på det praktiska, pipettering, mätning och framför allt märkning. 

Om jag nu i framtiden inte skall jobba med Southern eller PCR så har jag lärt mig en massa om hur man arbetar och detta kommer jag definitivt ha nytta av i framtiden och slipper orsaka en explosion. :P

http://www.kuntal.org/photo/var/resizes/33052-Clipart-Illustration-Of-A-Shocked-School-Girl-Conducting-A-Chemistry-Experiment-While-Her-Chemicals-Explode.jpg?m=1307569460

Laboration dag 3 - Måndag 19/9 2011

Syftet med tredje dagens laboration var att utföra elektrofores av klyvt material och Southern blot. Inmärkning av LL37-genen med DIG dUTP (random priming) och fixering av DNA till membran med UV bestrålning. Som avslutning gjordes en prehybridisering samt hybridisering över natten.

På grund av att det inte finns någon skriftlig angivelse på PingPong att tredje dagens laboration skall vara med, tänker jag kort med bilder presentera några av mina tankar under de mååånga timmarna på lab, lite bakgrund för Southern blot samt diskutera resultatet. 

1. Agarosgelen skulle "gjutas" till elektroforesen av den klyvda plasmiden (som gjordes förra dagen) samt den oklyvda plasmiden. Min laborationspartner och jag fick göra gelen 3 gånger innan vi lyckades få till den. Till skillnad från dag två då gelgjutningen gick så bra, läckte skiten ned i elektroforeskärlet hela tiden! MEN tredje gången gillt! Att misslyckas så här i början var inte precis den bästa starten på en laboration som pågick i nästan 9 timmar.

Skillnaden från förra dagens gel var att denna var dubbelt så tjockt. Detta var nödvändigt för att i senare steg inte få sönder gelen under olika preparationer. 

2. Olika preparationer av gelen skedde (se metod s. 24, i laborationskompendiet Laborationer Molekylärbiologisk metodik T3, HT-11) varpå en macka bildades. Mackan bestod av 3st vikta pappersdukar, 1 torr Watmanpapper, 2 Watmanpapper doppade i 10xSSC, nylonmembranet med gelen ovanpå (där DNA och brunnarna är vända mot membranet), plastfolie över allt detta, och avslutningsvist vikt i form av glasbägare med vatten ovanpå hela mackan. Lite krångligt var det att vända gelen, eftersom nylonmembranet suger åt sig DNA så fort den kommer i kontakt med det, var det viktigt att agarosgelen vändes på rätt sätt redan från början för att slippa felaktigt resultat senare.

Bild I: Den schematiska bilden över preparationen av en macka.

3. Fixering av DNA till membranet var viktigt för att DNA:t ej skall försvinna från membranet. Typ. 

Här nedan kan ni följa laborationen i bilder:

Den lyckade gelen är klar för elektrofores!

Brunnarna syns tydligt när den synliga LB har börjat vandra.

Förberedning av Watmanpapper till Mackan

Det övergivna provröret i 95 graders värme, i
väntan på denaturering av DNA under avsnittet:
"Random promed DNA labeling"

       

Tjock gel!

  

           Gelen preparerades i en del lösningar

Den berömda mackan i verklighet.

Efter fixeringen av membranet i UV-kabinett.

Resultat av elektroforesen:

Till skillnad från dag två, fick vi fina markörer med gelelektroforesen. De syns mycket tydligt på bilden (och i verkligheten). Orsaken till denna drastiska förändring beror med stor sannolikhet på att DNA koncentrationen i markör III respektive VI var dubbelt så hög som tidigare. 

Ingen band syns för den klyvda plasmiden med den lägsta koncentrationen på 0,005µg, orsaken till detta är just för låg koncentration. Däremot syns genen LL37, mycket tydligt under den klyvda plasmiden med koncentrationen 0,5µg. Den översta starkt lysande bandet för denna brunn visar att en del plasmid har ej hunnit klyvas och befinner sig i sin oklyvda form. Detta framgår tydligt vid jämförelse av brunn 1, där den oklyvda plasmiden har vandrat. Varför vi har använt oss utav två koncentrationer minns jag inte, och kan inte komma på vart jag skrev ned detta. 

Laboration dag 2 - Onsdag 14/9 2011

Syftet med andra dagens laboration var att genomföra PCR för kontroll av insert, elektrofores samt klyvning av plasmid-DNA med EcoR1 för att påvisa att genen LL37 finns.

För att vara så ovetenskaplig som möjligt kan jag konstatera att PCR är en jävligt intressant metod för att få fram flera tusen kopior av en önskad sekvens - i det här fallet genen LL37. Och bäst av allt är att enzymerna sköter jobbet! Nu när jag är som mest ovetenskaplig passar jag på att tillägga att även elektroforesen var rolig, lite pillrigt och stressigt var det dock att få till agarosgelen och förhindra att den rann ut från glasplattan då man hällde över den på glasskivan.

Efter gelelektroforesen av DNA skulle gelen fotogrageras i UV-kabinettet. Resultatet kan skådas i den första bilden här nedan:

BIld I: Fotografi över elektroforesens resultat

Bild II: Markör III respektive Markör VI, som det borde vara.


De båda testbrunnarna som kan ses på Bild I här intill bestod endast av Loading buffer (LB) och gjordes med syftet att träna på pipetteringen in i de smala och känsliga brunnarna. Att ingen sträck syns är positivt, då LB-bufferten ej skall innehålla någon DNA. 


Den negativa kontrollen innehöll Master Mix, vatten samt LB. Med denna kontroll vill man visa att ingen
carry over kontamination av testet har ägt rum, därför skall inga band synas. I våran (Camillas och min) bild, ser man ingen sträck i den negativa kontrollen vilket är ett lyckat resultat!


Markörerna III och VI syns inte så bra, vilket är mycket beklagligt med tanke på att det är med hjälp av markörerna som man fastställer om provet innehåller den sökta sekvensen, i detta fall genen LL37. Förklaringen till att markörerna blev så svaga är låg koncentration, som låg på 0,5µg/µL. Nästa gång då samma markörer skall användas får man dubbla koncentrationen för att förhoppningsvis få bättre resultat, så som det ser ut på Bild II ungefär.


Trots mindre lyckade markörer kan man fastställa att vår PCR-prov innehöll genen LL37. Detta kan göras då bandet på den positiva kontrollen ligger ungefär i nivå med det egna provet (jämför brunn 1 och 5) - på runt 550bp. Förklaringen till att det starkaste bandet på det egna provet ej befinner sig på exakt samma position som bandet i den positiva kontrollen, beror på att primerna binder lite inne i genen, vilket leder till att amplifikatet blir någorlunda kortare än själva genen LL37, vilket på bilden ger ett resultat av en liten "smear". Den positiva kontrollen innehöll Master Mix, den kända genen LL37, vatten samt LB. 




Sammanfattningsvis anser jag att laborationen har utförts på ett mycket bra sätt, då ingen carry over kontamination kan detekteras i den negativa kontrollen, på bilden, som är en resultat av gelelektroforesen. Samt att genen LL37 har detekterats genom denna metod.


Klyvning av DNA med restriktionsenzym EcoR1, var till för att klyva bort LL37-genen från bakteriernas plasmid som vi fick fram från dag 1. Den klyvda plasmiden lades för förvaring i frys till den nästkommande laborationen.


Att tänka till nästa gång:
 - Öka koncentrationen för Markör III samt VI om dessa skall användas
 - Ha ej den positiva kontrollen nära den negativa på grund av den höga kontamineringsrisken

Laboration dag 1 - Tisdag 6/9 2011

Syftet med första dagens laboration var att rena plasmid-DNA genom QIAgen samt göra en koncentrations och renhetsbestämmning

Bild 1: Modell över plasmidrening m.h.a
alkalisk denaturering och glaskolonn.

Det första reningssteget (en alkalisk denaturering) går generellt sett ut på lysering av bakterier (bakteriernas membran förstörs) och denaturering av DNA (för att bryta vätebindningarna mellan DNA:s två strängar). För att detta skall vara möjligt tillsattes P1-, P2- och N3-buffert i omgångar. Genom dessa steg separerar man bland annat plasmiden som innehåller LL-37-genen från annat oönskat material som RNA, DNA, proteiner samt rester av cellmembranet. 
I det andra reningssteget renar man plasmiden ytterligare från annat oönskat material som finns kvar efter det första reningssteget genom ett cilica membran som finns i en glasfiberkolonn. Allt som flödar igenom denna membran kastas i omgångar, för att till slutändan ha kvar endast "ren" plasmid.


För att plasmiden skall kallas för "ren" måste dess absorbans mätas i en spektrofotometer. En ren plasmidlösning bör ha en kvot på 1.8 - 1.9 vid absorbans 260nm samt 280nm (A260/A280 = eller >1.8). Ett värde som är mindre än 1.8 tyder på att provet är kontaminerat. 


Min labpartners (Camilla Holmgren) och min kvot för plasmidlösningen blev:
A260/A280 = 0.075/0.041 = 1.83

Bild 2: Absorbanskurva samt absorbans
vid våglängd 260nm

Detta resultat visar att vårat prov är proteinfritt, MEN det innebär inte att den är HELT ren, föroreningar KAN dock förekomma.

DNA-koncentrationen i plasmidlösningen kunde senare beräknas med hjälp av absorbansen. Vid våglängden 260nm motsvarar en absorbansenhet 50µg/mL dsDNA. Detta innebär att koncentrationen (c) kan räknas ut på detta sätt:


c = (A260*50)/1000µL = 0.00375 µg/µL


Eftersom lösningen som vi använde var utspätt 100 gånger med TE-buffert kan man multiplicera med hundra för att få fram koncentrationen i den ursprungliga plasmidlösningen:


c = 0.00375*100= 0.375 µg/µL




Bild 1: http://www.roche-applied-science.com/sis/nucleic-acid-isolation-purification/index.jsp?id=NAP_040100

Testinlägg

blablalba