Syftet med första dagens laboration var att rena plasmid-DNA genom QIAgen samt göra en koncentrations och renhetsbestämmning
 |
| Bild 1: Modell över plasmidrening m.h.a alkalisk denaturering och glaskolonn. |
I det andra reningssteget renar man plasmiden ytterligare från annat oönskat material som finns kvar efter det första reningssteget genom ett cilica membran som finns i en glasfiberkolonn. Allt som flödar igenom denna membran kastas i omgångar, för att till slutändan ha kvar endast "ren" plasmid.
För att plasmiden skall kallas för "ren" måste dess absorbans mätas i en spektrofotometer. En ren plasmidlösning bör ha en kvot på 1.8 - 1.9 vid absorbans 260nm samt 280nm (A260/A280 = eller >1.8). Ett värde som är mindre än 1.8 tyder på att provet är kontaminerat.
Min labpartners (Camilla Holmgren) och min kvot för plasmidlösningen blev:
A260/A280 = 0.075/0.041 = 1.83
 |
| Bild 2: Absorbanskurva samt absorbans vid våglängd 260nm |
Detta resultat visar att vårat prov är proteinfritt, MEN det innebär inte att den är HELT ren, föroreningar KAN dock förekomma.
DNA-koncentrationen i plasmidlösningen kunde senare beräknas med hjälp av absorbansen. Vid våglängden 260nm motsvarar en absorbansenhet 50µg/mL dsDNA. Detta innebär att koncentrationen (c) kan räknas ut på detta sätt:
c = (A260*50)/1000µL = 0.00375 µg/µL
Eftersom lösningen som vi använde var utspätt 100 gånger med TE-buffert kan man multiplicera med hundra för att få fram koncentrationen i den ursprungliga plasmidlösningen:
c = 0.00375*100= 0.375 µg/µL
Bild 1: http://www.roche-applied-science.com/sis/nucleic-acid-isolation-purification/index.jsp?id=NAP_040100
Hej,
SvaraRaderaMycket bra svar, konstruktion och bra upplysning av bilen, men jag undrar vad är visten men p1,p2 och N3 bufferter?dvs vad innehåller de som gör denna rening?
Du säger, enligt din A280/A360 kvott(=1,83), att din plasmislösning är proteinfritt.Men så är det inte enligt absorbans graffen,annars vad är det som absorberar ljus vid 280 nm?Är det inte proteinernas absorbans maximum vid 280nm?
Tack!
Hej Alina!
SvaraRaderaJätte fin blogg du gjort! Man hänger lättare med i texten med hjälp av bilderna:)
Jag funderade också lite på de redwan skrev, men annars tycker jag att du tagit med allting.
De är bra att du påpekar att kvoten 1,83 inte innebär att provet är rent från andra föroreningar;)
Bra skrivit Alina!
//Rosa
Hej Alina, vilken trevlig blog du har med massa fina bilder. Jag tycker du skrivit mycket bra jag funderade bara lite kring renhetskvoten jag också, som du säger kan det ju finnas föroreningar trots att kvoten var bra..vilka föroreningar kan det vara? jag menar att det kunde varit bra att tydliggöra att det tex. kan finnas kromosomalt DNA eller RNA kvar vilka oxå absorberar vid de våglängderna vi mätt på. Annars toppen bra!
SvaraRaderaHej Alina,
SvaraRaderaKromosomalt DNA om den kommer med supernatanten ,yes kommer att fälla på silica membran på samma sätt som plasmid DNA gör.
Hög pH innebär mindre väte jon koncentration i lösning,då aminosyror i proteinet släpper protoner till lösningen för att kompensera hög pH,på så sätt deras 3D struktur ändras(denatureras).
Hög pH änrar basernas stuktur i DNA som gör att de kan ej binda vätebindningar med varandra,då dsDNA blir ssDNA(tapar formen=denaturerar).
Hoppas jag har svarat på dina frågor
Tack!