Syftet med andra dagens laboration var att genomföra PCR för kontroll av insert, elektrofores samt klyvning av plasmid-DNA med EcoR1 för att påvisa att genen LL37 finns.
För att vara så ovetenskaplig som möjligt kan jag konstatera att PCR är en jävligt intressant metod för att få fram flera tusen kopior av en önskad sekvens - i det här fallet genen LL37. Och bäst av allt är att enzymerna sköter jobbet! Nu när jag är som mest ovetenskaplig passar jag på att tillägga att även elektroforesen var rolig, lite pillrigt och stressigt var det dock att få till agarosgelen och förhindra att den rann ut från glasplattan då man hällde över den på glasskivan.
Efter gelelektroforesen av DNA skulle gelen fotogrageras i UV-kabinettet. Resultatet kan skådas i den första bilden här nedan:
 |
| BIld I: Fotografi över elektroforesens resultat |
Bild II: Markör III respektive Markör VI, som det borde vara.
De båda testbrunnarna som kan ses på Bild I här intill bestod endast av Loading buffer (LB) och gjordes med syftet att träna på pipetteringen in i de smala och känsliga brunnarna. Att ingen sträck syns är positivt, då LB-bufferten ej skall innehålla någon DNA.
Den negativa kontrollen innehöll Master Mix, vatten samt LB. Med denna kontroll vill man visa att ingen
carry over kontamination av testet har ägt rum, därför skall inga band synas. I våran (Camillas och min) bild, ser man ingen sträck i den negativa kontrollen vilket är ett lyckat resultat!
Markörerna III och VI syns inte så bra, vilket är mycket beklagligt med tanke på att det är med hjälp av markörerna som man fastställer om provet innehåller den sökta sekvensen, i detta fall genen LL37. Förklaringen till att markörerna blev så svaga är låg koncentration, som låg på 0,5µg/µL. Nästa gång då samma markörer skall användas får man dubbla koncentrationen för att förhoppningsvis få bättre resultat, så som det ser ut på Bild II ungefär.
Trots mindre lyckade markörer kan man fastställa att vår PCR-prov innehöll genen LL37. Detta kan göras då bandet på den positiva kontrollen ligger ungefär i nivå med det egna provet (jämför brunn 1 och 5) - på runt 550bp. Förklaringen till att det starkaste bandet på det egna provet ej befinner sig på exakt samma position som bandet i den positiva kontrollen, beror på att primerna binder lite inne i genen, vilket leder till att amplifikatet blir någorlunda kortare än själva genen LL37, vilket på bilden ger ett resultat av en liten "smear". Den positiva kontrollen innehöll Master Mix, den kända genen LL37, vatten samt LB.
Sammanfattningsvis anser jag att laborationen har utförts på ett mycket bra sätt, då ingen carry over kontamination kan detekteras i den negativa kontrollen, på bilden, som är en resultat av gelelektroforesen. Samt att genen LL37 har detekterats genom denna metod.
Klyvning av DNA med restriktionsenzym EcoR1, var till för att klyva bort LL37-genen från bakteriernas plasmid som vi fick fram från dag 1. Den klyvda plasmiden lades för förvaring i frys till den nästkommande laborationen.
Att tänka till nästa gång:
- Öka koncentrationen för Markör III samt VI om dessa skall användas
- Ha ej den positiva kontrollen nära den negativa på grund av den höga kontamineringsrisken
Hej,
SvaraRaderaEn mycket fint och bra upplysning av resultat och lab arbetet, eftersom man för en snabb uppfattning av hur lab arbetet går till och vad man får för resultatet genom de finna sammanfattnings bilderna.
I den negativa kotrollen även om man ser svagt band som har vandrat längst ner i gelet, bevisar att ingen carry over kontamination har skedd. Eftersom de svaga band representerar primerna som har inte förbrukats i PCR reaktionen.(ingen templat i den negativa kontrollen).
Du förklarar att varför din PCR prov och +ve kontroll band ligger inte i exakt samma position, men hur kan primerna hybridisera inne i mål område tröts att de konstruerade för att bara binda specifikt och till vis sekvens på templat strängen? vad som orsakade detta?
Tack!
Hej Alina,
SvaraRaderaVilken snygg blogg du gjort!
Ni har fått en bra preparation och du har skrivit bra om rening och absorbansmätning. Du har också påpekat att även om absorbansvärdena ser bra ut så innebär inte det att det är ren plasmid. Kanske kunde du vara tydlig med att de föroreningar som det kan vara fråga om här framförallt är annan nukleinsyra.
Elektroforesen däremot visar ju tydligt att ni inte har något kontaminerande kromosomalt DNA eller RNA.
Tråkigt att markörerna blev så svaga, men ni ser ju som sagt att ni fått ett amplifikat i rätt storleksordning med hjälp av den positiva kontrollen. Att de inte ligger exakt samma höjd beror nog snarast på elektroforesen eftersom det är exakt samma sekvens som amplifierats i positiva kontrollen (som ju också Radwan skriver om).
Annica
Hej Alina!
SvaraRaderaJag tyckte att ni fick ett jätte bra resultat precis som du påpekat! Roligt med bilderna du la upp, man får en översiktlig helhet över laborationen;)
De är bra att du funderat på vad de beror på att ni fått så svag färg på markörerna, frågan är bara vad är de som motsvarar lite koncentration av, för att få starkare färg på banden... gelred?
//Rosa
Hej Alina, igen mycket trevligt skriven blog! Bra att du tar upp och reflekterar över felkällorna. Jag tänkte bara på om du kunde kopla ihop det här resultatet med resultatet från föregående dag, kan du nu säga med säkerhet om du fått ren plasmid eller inte?
SvaraRadera/Sofia