Laboration dag 3 - Måndag 19/9 2011

Syftet med tredje dagens laboration var att utföra elektrofores av klyvt material och Southern blot. Inmärkning av LL37-genen med DIG dUTP (random priming) och fixering av DNA till membran med UV bestrålning. Som avslutning gjordes en prehybridisering samt hybridisering över natten.

På grund av att det inte finns någon skriftlig angivelse på PingPong att tredje dagens laboration skall vara med, tänker jag kort med bilder presentera några av mina tankar under de mååånga timmarna på lab, lite bakgrund för Southern blot samt diskutera resultatet. 

1. Agarosgelen skulle "gjutas" till elektroforesen av den klyvda plasmiden (som gjordes förra dagen) samt den oklyvda plasmiden. Min laborationspartner och jag fick göra gelen 3 gånger innan vi lyckades få till den. Till skillnad från dag två då gelgjutningen gick så bra, läckte skiten ned i elektroforeskärlet hela tiden! MEN tredje gången gillt! Att misslyckas så här i början var inte precis den bästa starten på en laboration som pågick i nästan 9 timmar.

Skillnaden från förra dagens gel var att denna var dubbelt så tjockt. Detta var nödvändigt för att i senare steg inte få sönder gelen under olika preparationer. 

2. Olika preparationer av gelen skedde (se metod s. 24, i laborationskompendiet Laborationer Molekylärbiologisk metodik T3, HT-11) varpå en macka bildades. Mackan bestod av 3st vikta pappersdukar, 1 torr Watmanpapper, 2 Watmanpapper doppade i 10xSSC, nylonmembranet med gelen ovanpå (där DNA och brunnarna är vända mot membranet), plastfolie över allt detta, och avslutningsvist vikt i form av glasbägare med vatten ovanpå hela mackan. Lite krångligt var det att vända gelen, eftersom nylonmembranet suger åt sig DNA så fort den kommer i kontakt med det, var det viktigt att agarosgelen vändes på rätt sätt redan från början för att slippa felaktigt resultat senare.

Bild I: Den schematiska bilden över preparationen av en macka.

3. Fixering av DNA till membranet var viktigt för att DNA:t ej skall försvinna från membranet. Typ. 

Här nedan kan ni följa laborationen i bilder:

Den lyckade gelen är klar för elektrofores!

Brunnarna syns tydligt när den synliga LB har börjat vandra.

Förberedning av Watmanpapper till Mackan

Det övergivna provröret i 95 graders värme, i
väntan på denaturering av DNA under avsnittet:
"Random promed DNA labeling"

       

Tjock gel!

  

           Gelen preparerades i en del lösningar

Den berömda mackan i verklighet.

Efter fixeringen av membranet i UV-kabinett.

Resultat av elektroforesen:

Till skillnad från dag två, fick vi fina markörer med gelelektroforesen. De syns mycket tydligt på bilden (och i verkligheten). Orsaken till denna drastiska förändring beror med stor sannolikhet på att DNA koncentrationen i markör III respektive VI var dubbelt så hög som tidigare. 

Ingen band syns för den klyvda plasmiden med den lägsta koncentrationen på 0,005µg, orsaken till detta är just för låg koncentration. Däremot syns genen LL37, mycket tydligt under den klyvda plasmiden med koncentrationen 0,5µg. Den översta starkt lysande bandet för denna brunn visar att en del plasmid har ej hunnit klyvas och befinner sig i sin oklyvda form. Detta framgår tydligt vid jämförelse av brunn 1, där den oklyvda plasmiden har vandrat. Varför vi har använt oss utav två koncentrationer minns jag inte, och kan inte komma på vart jag skrev ned detta.